Human mesenchymal stem cells Biological Effectiveness Evaluation of key quality attributes and evaluation -- hMSCs multidirectional differentiation potential

临床应用的hMSCs应具有四类质量属性：基本细胞生物学属性，微生物学安全性，生物学安全性和生物学有效性。其中生物学有效性与hMSCs临床治疗效应密切相关，是临床前研究阶段用于预测临床治疗效应，是现阶段乃至未来决定hMSCs临床转化是否能成功的重要质量属性。不同组织来源的 hMSCs生物学有效性质量属性，可归类为诱导分化功能、免疫调控能力及组织再生功能，而每一类别中又含有细化的内容(或质量属性)。

体外评价hMSCs细胞向不同谱系的分化能力是hMSCs生物学有效性质量评价的关键质量属性，接下来就hMSCs的生物学有效性评价中的多向分化潜能作详细介绍。

hMSCs在特定体外诱导分化培养条件下，具有向内、中、外胚层不同细胞系分化的潜能。在体外质量评价实验中，可以通过特定的诱导条件将hMSCs向特定功能细胞分化，进而运用不同检测技术对分化细胞的相关生物学特性或功能进行评价。目前普遍接受由ISCT于2006年首次提出的以成骨、成脂、成软骨细胞诱导分化能力的评价方法。

一、 hMSCs成骨细胞诱导分化：

在体外培养条件下，经过特定诱导条件使hMSCs分化发育为成骨细胞。通常将这个分化过程划分为细胞增殖期、分化早期、分化中晚期三个阶段。hMSCs 在贴壁后就开始进入细胞增殖阶段，以DNA复制和组蛋白合成为特征。分化早期则以碱性磷酸酶活性升高、I型胶原分泌为特征，同时还伴有细胞增殖抑制。分化中晚期主要以钙离子的沉积为特征。故常通过检测钙离子沉淀“钙结节”的量来表示成骨分化的强弱。

茜素红S是橙黄色的针状体，由茜素经发烟硫酸磺化，然后转变为钠盐制得。属一种蒽醌(Anthraquinone)类的衍生物，是茜素磺酸钠盐，它能与钙盐以鳌和方式形成橘红色复合物，用以识别组织细胞的钙盐成分。经茜素红(alizarin red)染色呈阳性，提示成骨诱导分化后细胞内可形成矿化基质。

二、 hMSCs成脂细胞诱导分化：

人和哺乳动物体内的脂肪组织可以分为白色脂肪组织和棕色脂肪组织，两种脂肪组织的细胞中均含有脂肪，但是他们在分布位置和结构功能上有所区别。白色脂肪组织普遍分布在皮下组织和内脏周围，主要起能量仓库的作用，将多余的能量以脂肪的形式储存起来。棕色脂肪组织主要分布在颈部两侧、背部上侧、锁骨附近和脊柱周围，其细胞内含有大量线粒体，可以将食物中的能量转化为热能。

hMSCs在相关诱导分化培养基培养14～28 d后，经油红O(oil red 0)染色为阳性，根据脂肪组织细胞的特点：细胞浆中含有脂肪滴，可以通过油红O对细胞中脂肪滴染色。说明分化的细胞内形成脂滴。

油红O（苏丹红）是一种脂溶性偶氮染料，能特异性地使组织和细胞内中性甘油三脂、脂质以及脂蛋白等染色。油红 O 配成染色液用于染色时，可以通过相似相溶的原理使组织或细胞内的脂滴着红色，可用于分析组织或细胞样本中的脂质分布情况。

三、 hMSCs成软骨细胞诱导分化：

具有成软骨分化能力的hMSCs细胞在诱导培养过程中，可以自发收缩聚集形成细胞微球，并逐渐形成具有一定硬度和弹性并呈白色外观的软骨样子组织。该组织经阿利新蓝染色呈阳性。（在间充质干细胞诱导分化为软骨细胞后，细胞可以合成并分泌大量细胞外基质，其中包括富含透明质酸的糖胺聚糖，可以被阿利新蓝染成蓝色。）伴随软骨细胞分化，Ⅱ型胶原等软骨细胞特定基因表达水平会显著上调，因此可利用在软骨分化条件下，hMSCs成细胞球能力、形成软骨组织形态能力、番红O或阿新蓝染色及软骨特定基因表达上调情况综合判断hMSCs成软骨细胞分化能力。

这种基于三维细胞培养、形态学观察和阿利新蓝染色的检测方法可以提供相对明确的成软骨细胞分化能力的信息。

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无菌检测、支原体检测，确保产品无微生物污染或代谢产物污染；

生物学安全性检测

成瘤性和致瘤性检测、异常免疫反应检测、残留物的检测；

生物学有效性评价

多向分化功能的评价、免疫调控功能的评价、hMSCs组织再生功能的评价

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