CAR-T生产工艺流程及优化考量（上）

发布时间：2020-08-11 13:13 信息来源：阅读次数：次

细胞毒性CD8+CART细胞，直接介导肿瘤细胞清除，但是CD4+辅助细胞(Th细胞)同样有着重要作用。CD4+和CD8+CART应该有一个合适的比例，有报道，治疗B-ALL中，1：1会获得产生更好的肿瘤消退疗效。

调节性T细胞浸润到实体肿瘤局部，会降低CD28-CD3ζ信号通路活性。去除CD28CAR胞内段的Lck结合结构域，即使在调节性T细胞存在的情况下，也有强抗肿瘤活性。

低分化的初始样T细胞（naïve-like T cells ，TN cells，表型CD45RA+ CD45RO- CD95-，CCR7+，CD62L+，CD28+，CD27+)和干细胞记忆样T细胞（Stem cell memory-like T cells ，TSCM cells，表型CD45RA+ CD45RO- CCR7+CD95+)具有更强的增殖能力和自我更新能力，以及分化为效应和记忆T细胞的能力，因而有产生更好临床结果的潜能，更持久的抗肿瘤活性。

而分化的效应样T细胞（T effector-like cells，TEff cells，表型CD45RA+ CCR7-)虽然体外表现初强的抗肿瘤活性，但是在体内，活化和增殖等能力均受损。

肿瘤高表达免疫检查点配体，免疫细胞高表达免疫检查点受体，则病人对于CART缺乏应答。

T细胞需要表达淋巴组织归巢分子（CCR7和CD62L），有助于浸润到肿瘤局部，起到更好的治疗效果。如上文，TN和TSCM表达归巢受体，而Teff不表达归巢受体。高表达CXCR2和GD2也有助于CAR-T浸润到肿瘤组织。

1. 细胞分离和富集

分离方法：传统方法Ficoll密度梯度离心用于去除颗粒细胞、红细胞和血小板；自动化的分离系统：Sefia Cell Processing System，CliniMACS Prodigy。

基于CD3+进行细胞分选，然后以磁珠为基础的技术如CliniMACS Prodigy，使用anti-CD3，anti-CD4，anti-CD8磁珠分选或者去除特定的细胞群，以获得合理比例的CD4：CD8。

特定未分化的TN，TSCM，TCM细胞对于临床是有益的，但是分选流程复杂，在实际生产流程中有一定困难。

2. T细胞激活

2.1anti-CD3/anti-CD28抗体活化

使用抗CD3（OKT-3单克隆抗体）/抗CD28抗体包被磁珠作为人工抗原提呈颗粒，anti-CD3提供增殖信号，anti-CD28提供共刺激信号。活化之后，磁珠可被磁铁去除掉。

和可溶性OKT-3抗体相比，抗体包被磁珠活化细胞，具有更少的分化，更少衰老的特点。另外富集和清洗细胞会更加简单，昂贵抗体的丢失更少。因而磁珠法是生产工艺中最常用的方法，如诺华的Kymriah。

最近一种特殊的聚合物纳米基体产品(T Cell TransAct)，上面结合有人源化CD3和CD28抗体，结合使用无血清培养基(TexMACS)，用于T细胞活化。这种方法增加了高表达CD62L，CCR7的 TCM细胞，减少CD57+耗竭T细胞，但是不改变PD-1的表达和基因转染效率，而且细胞裂解活性降低。

2.2 Retronectin

Retronectin是另外一种活化策略，使用重组纤维连接片段，同时可以增加逆转录病毒的感染效率。Retronectin和板结合CD3抗体，或者anti-CD3/anti-CD28磁珠，用于GD2特异性CART和CD19特异性CART，增加TN和TSCM的比例。但是T细胞活化弱，扩增弱，细胞因子分泌少等是缺点。

2.3 人工APC细胞

人工APC递呈TAA给CART，使其活化。比如使用K-562同时表达TAA和共刺激分子，不表达HLA-A，HLA-B，仅可用于TAA特异性CART活化。

3. 基因转导系统

3.1病毒转导

病毒转染系统转染效率高，最常用的是逆转录病毒载体和慢病毒载体。逆转录病毒将病毒DNA整合到宿主DNA中，产生稳定的转染。慢病毒需要调节基因来中和宿主细胞的防御，削弱免疫反应，以及调节病毒复制。慢病毒载体，插入诱变和致癌的风险很低。

逆转录病毒生产需要大量的包装细胞，而慢病毒载体生产需要大量质粒DAN进行瞬时转染。病毒的生产需要GMP级别的生产车间和一系列的检测方法，是病毒转染细胞最大瓶颈。

诺华的Kymriah® (Tisagenlecleucel)和施贵宝Lisocabtagene maraleucel (liso-cel; JCAR017)均使用慢病毒载体。Kite Yescarta (axicabtagene ciloleucel) 使用逆转录病毒。

3.2 基于质粒的基因传递

转座子/转座酶系统是一种替代的非病毒基因传递策略。采用“睡美人”转座子/转座酶系统进行CART制造。该系统由两个DNA质粒组成，一个编码CAR，第二表达转座酶，这是切除和插入转基因所必需的。这种方法不需要GMP车间生产病毒，成本低。在第一代CART和第三代CART中被使用，产品已经开始在临床实验中使用。

3.3 基因编辑

CRISPR/Cas9能够特异性地破坏多个基因的基因组基因座。CRISPR/Cas9系统结合腺相关病毒(AAV)载体，将CAR的DNA整合入T细胞受体a，提高T细胞效力，抑制T细胞分化和衰竭。使用基因编辑和慢病毒转导，用于产生PD-1缺陷的CD19特异性CART，增强抗肿瘤活性。

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