干货 | 支原体检查的几种方法比较

支原体能够在特定的固体琼脂培养基上形成经典的“油煎荷包蛋”式的菌落，因此可以在固体培养基上培养支原体，通过观察菌落形态以判断是否存在支原体污染。这是最直观的方法，也是最早的方法，但人们后来发现有很多支原体难以在固体培养基上形成菌落，因此，该法容易造成假阴性结果。

支原体在液体培养基中也能够较好地生长，在支原体数目增长到一定程度之后，培养基中的PH值会发生显著变化，如果在培养基中添加指示剂，这种变化会非常直观地显现出来。

单纯的液体培养基检测经常受到指示剂加入量、变色范围较小等因素的干扰。因此液体培养法和固体培养法通常一起使用，使检测结果更加可靠。培养法的检测时间在28天左右，时间较长。

大多数支原体的DNA中AT碱基的含量较高（55%~80%），DNA荧光染料Hoechst 33258或DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)可以结合到AT含量较高的DNA链上。所以在使用荧光染料染色后，被支原体污染的指示细胞除了细胞核发出荧光外，细胞表面、周围培养基和培养皿中也含有荧光小点。

为防止检测结果出现细胞破裂后散出DNA等不确定因素造成假阳性或不清晰的实验结果，通常会使用待检测样品的培养液，去感染易使支原体增殖的指示细胞（无污染的Vero细胞或经药品检定机构认可的其他细胞），故又称指示细胞法。

对于细胞粘附性比较差的支原体（精氨酸类支原体），染色法的检出效果较差，所以在实际检测过程中通常将染色法和培养法结合起来进行结果判定。

注：对可能引起指示细胞病变的且缺少有效中和抗体的高滴度病毒样本来说，不能使用DNA染色法进行检测。

相较于其他PCR技术，实时荧光定量PCR法可以通过观察荧光扩增曲线的扩增情况来实时检测支原体的污染情况，具有较好的特异性和准确性。并且不需要在PCR扩增后再进行凝胶电泳，缩短了实验时间，降低了交叉污染的风险。

虽然支原体核酸扩增检测法弥补了培养法和DNA染色法耗时长的缺点，也在一定程度上增加了检测的灵敏度，但因其阳性检出率往往受到引物所能扩增的支原体种类的制约，且容易受到样品核酸提取方法、与支原体亲缘关系较近的基因干扰等外源因素的影响。所以验证每种支原体核酸检测方法的检测限(Detection Limit)、特异性(Specificity)、耐用性(Robustness)是非常必要的。